Un instrument fundamental pentru caracterizarea, selecția și ameliorarea speciilor vegetale îl constituie noile tehnici de genetică moleculară, care pot furniza informații privind genele și secvențele specifice asociate cu particularități fenotipice de interes economic.
Tehnologia NGS-Next Generation Sequencing permite amelioratorilor posibilitatea de a cunoaște secvențele genice specifice importante din punct de vedere agronomic și poziționarea lor relativă, pentru a dezvolta ulterior noi markeri moleculari utilizați în accelerarea programelor de ameliorare a speciilor de interes agricol și horticol. În cadrul acestui proiect se urmărește caracterizarea și identificarea polimorfismului genetic ADN posibil asociat unor caractere de interes al speciilor autohtone, în scopul selecției și identificării unor noi markeri moleculari asociaţi cu variațiile fenotipice de interes, utilizând tehnici moderne de genotipare.
În cadrul proiectului se urmărește optimizarea metodelor și tehnicilor de analiză moleculară a ADN-ului genomic și aplicarea acestora în analiza genotipurilor de interes economic ale unor specii legumicole și pomicole, cultivate în România. Pentru caracterizarea, selecția și ameliorarea soiurilor se vor utiliza tehnici de analiză moleculară de genotipare prin secvențiere care vor furniza informații privind descoperirea de noi markeri moleculari (SNP) asociați cu genele de interes, pentru creșterea rezistenței plantelor la atacul de boli și dăunători, adaptarea la schimbările climatice (stres biotic și abiotic), însușiri calitative și cantitative superioare.
Utilizând tehnologia NGS se vor compara secvențele nucleotidice obținute și se va realiza o bază de date a variațiilor genetice specifice speciilor autohtone pentru minimum 4 specii legumicole și pomicole, cu minim 6 varietăți, în vederea utilizării acestor informații pentru creșterea producției și veniturilor fermierilor din România. Detectarea variațiilor genetice relevante din punct de vedere funcțional vor contribui la identificarea genelor și secvențelor specifice asociate speciilor autohtone.
Proiect finanţat prin: Ministerul Agriculturii și Dezvoltării Rurale
Tip proiect: Plan Sectorial 2019-2022 – ADER 2022
Titlu proiect: Cercetări privind variația genetică, analizată prin tehnologia de secvențiere de ultimă generație – NGS, la speciile legumicole și pomicole de interes economic, în vederea genotipării acestora și obținerea unei baze de date a variațiilor genetice specifice speciilor autohtone
Acronim proiect: ADER 7.2.6.
Contract nr.: 7.2.6/19.09.2019
Valoarea proiectului: 1.500.000 lei
Durata proiectului: 36 luni
Perioada de derulare: 19.09.2019-15.09.2022
Autoritatea Contractantă: Ministerul Agriculturii și Dezvoltării Rurale, Plan sectorial pentru cercetare-dezvoltare din domeniul agricol pe anii 2019-2022
Contractor: Universitatea de Ştiinţe Agronomice şi Medicină Veterinară din Bucureşti
Director de proiect: CS III dr.ing. UDRIȘTE Anca Amalia
Proiectul are următoarele obiective:
Coordonator: Universitatea de Ştiinţe Agronomice şi Medicină Veterinară din Bucureşti/ Centrul de Cercetare pentru Studiul Calității Produselor Agroalimentare
Parteneri:
Universitatea de Ştiinţe Agronomice şi Medicină Veterinară din Bucureşti:
Faza I
Faza II
Faza III
Faza IV
FAZA II. Analiza diversității genetice a speciilor legumicole autohtone
Perioadă raportare: 1.11.2019-31.10.2020
REZULTATE REALIZATE
A. Optimizarea metodelor de extracție a ADN-ului genomic
Pentru a asigura implementarea cu succes a analizei PCR, optimizarea metodelor de extracție a ADN-ului genomic este prioritară, în scopul obținerii unor rezultate privind concentrația, calitatea și puritatea ADN-ului genomic de înaltă calitate. Pentru optimizarea metodelor de extracție a ADN-ului genomic, s-a folosit țesut vegetal provenit de la speciile legumicole autohtone de ardei (Capsicum annuum) și tomate (Solanum lycopersicum), 7 varietăți și respectiv 9 varietăți. S-a urmărit optimizarea extracției de ADN genomic prin 3 protocoale de extracție automată și 5 protocoale de extracție manuală. Țesutul vegetal tânăr, respectiv primele frunze au fost colectate și folosite pentru extracția de ADN genomic. În urma rezultatelor obținute, CP și partenerii au selectat 3 metode optimizate, din care 1 automată și 2 manuale, care au produs cele mai bune concentrații de ADN genomic necesare activităților ulterioare.
B. Analiza calității ADN-ului genomic extras
După procesul de extracție automată și manuală, s-a determinat puritatea și concentrația ADN-ului spectrofotometric, iar interpretările graficului spectral al probelor analizate au indicat o puritate bună prin citirea concentrației de ADN în ng/µL, de ex. pentru extracția automată fiind în intervalul optim de 1,8-2,0. Probele extrase au fost verificate în gel de agaroză, iar detecția moleculelor de ADN a fost vizualizată in UV și documentată prin asocierea cu compuși fluorescenți. Au fost selectate probele de ADN genomic prezentând ADN în cantitate optimă, nefragmentat și fără impurități și au fost pregătite pentru reacția PCR.
C. Dezvoltarea și optimizarea unor metode enzimatice pentru selecția variantelor alelice
Peste 80 primeri au fost selectaţi pe baza literaturii de specialitate pentru a amplifica markeri moleculari bazați pe reacția PCR, de tip markeri dominanti (RAPD și ISSR) și markeri co-dominanti (SSR), TBP, cTBP, hTBP, SRAP, ScoT, DAMD, pentru analiza polimorfismului genetic al probelor studiate. Strategia utilizării markerilor moleculari se bazează pe evidenţierea polimorfismului molecular, polimorfism care la genomurile plantelor este datorat, în mare parte, variaţiei cantităţii de ADN repetitiv. Primerii RAPD sunt decameri, primerii ISSR sunt primeri compuși dintr-o secvență de microsateliți ancorată la capătul 3’ sau 5’ cu 2-4 nucleotide arbitrare, iar cei SSR sunt compuși din primeri forward și reverse ce amplifică secvenţele microsatelit constituite din repetiţii în tandem ale unor secvenţe di, tri sau tetra nucleotidice, cele mai frecvente fiind secventele dinucleotidice, de exemplu (AC)n/ (AT)n.
D. Analiza diversității genetice la tomate și ardei cu ajutorul markerilor moleculari pentru stabilirea identității soiurilor/hibrizilor/surselor parentale prin amprentarea genomică
Caracterizarea și identificarea polimorfismului genetic al ADN-ului pentru speciile și soiurile selectate s-a făcut folosind markeri moleculari RAPD, ISSR, SSR, TBP, SCoT, SRAP, DAMD-PCR. Dintr-o selecție de 60 primeri RAPD, ISSR și SSR, coordonatorul principal a obținut polimorfism molecular ridicat cu 46 primeri ce au condus la amplificarea markerilor moleculari specifici RAPD, ISSR și SSR, astfel: 18 primeri au produs un polimorfism ridicat la cele 7 varietăți de ardei și 28 primeri au produs un polimorfism ridicat la cele 9 varietăți de tomate luate în studiu.
La varietățile de ardei analizate, polimorfismul rezultat în urma utilizării primerilor RAPD a rezultat în generarea a 200 fragmente de PCR. Primerii ISSR au generat aproximativ 365 fragmente de PCR. Dintr-un total de 10 perechi de primeri SSR 5 perechi de primeri au produs polimorfism prin obținerea a aproximativ 68 fragmente mici de PCR (microsateliți).
La varietățile de tomate luate în studiu, 11 primeri universali RAPD au produs polimorfism moderat și au generat 346 fragmente de PCR. Un total de 11 primeri ISSR au produs un polimorfism moderat la cele 9 varietăți de tomate și am obținut aproximativ 698 fragmente de PCR. Fiecare primer a amplificat intre 1-15 fragmente ADN per probă. Dintr-un total de 10 perechi de primeri SSR, 6 perechi de primeri au produs polimorfism moderat la cele 9 varietăți de tomate luate în studiu prin generarea a 191 fragmente de PCR.
Pentru partenerul P1 toate tehnicile utilizate în această fază (TBP, cTBP, hTBP, SRAP, ScoT, DAMD) au generat polimorfism, mai puțin tehnica TBP în cazul tomatelor.
Pentru partenerul P3 analiza diversității genetice pentru soiurile de tomate analizate, au fost testați 9 primeri RAPD și 10 primeri SSR. Dintre aceștia, s-a reușit stabilirea protocolul optim de amplificare pentru 5 primeri SSR, dintre care 2 sunt mono-morfici și 3 determină separarea unor benzi multiple a căror dispoziție în gel este specifică fiecărui soi. Dintre primerii RAPD, s-au obținut produși de amplificare la 5 dintre aceștia.
Interpretarea datelor moleculare s-a realizat atât pentru variantele de tomate, cât și pentru cele de ardei cu un program bioinformatic reprezentat de un set de programe R care analizează biodiversitatea în cadrul grupurilor selectate prin calculul heterozigoției, frecvența alelelor, procentul de loci polimorfi, analiza clusterului prin generarea unei dendrograme pentru identificarea de clase sau grupe distincte, distanța genetică prin calculul Rogers Distances, graficul 3D de scalare multidimensională.
E. Monitorizarea în cultură a caracterelor fenotipice asociate genotipurilor luate în studiu pe tot parcursul derulării proiectului
În cadrul acestei activități s-au realizat următoarele activități la CP și P3: producerea și pregătirea de răsaduri pentru soiurile analizate; înființare loturi experimentale și întreținerea acestora; determinări biometrice în 4 fenofaze: faza de răsad, faza înfloritului, faze de legare în masă și creștere activă a fructelor, faza de maturitate și coacere a fructelor (maturitate fiziologică, tehnologică sau de consum); înregistrarea producției de fructe în dinamică; crearea bazelor de date cu fișele de observații și determinări biometrice realizate. CP a beneficiat, în cadrul unui contract, de serviciile de expertiză ale SCDL Buzău care a realizat și urmărit loturile experimentale pentru ardei și tomate luate în experiență, furnizând probe pentru analiza moleculară, cât și datele fenotipice necesare realizării acestei activități. Tot în cadrul acestei monitorizări fenotipice, partenerul P2 a realizat loturile experimentale de pomi fructiferi (măr și prun autohton), organizând 2 câmpuri experimentale, unul pentru măr în cadrul unui lot demonstrativ ce urmăreşte studierea unor soiuri cu rezistenţă genetică la rapăn (6 din cele 8 soiuri sunt soiuri cu rezistenţă genetică la rapăn) şi care cuprinde şi unele genotipuri vechi printre care soiurile Creţesc şi Domnesc, şi altul pentru prun în cadrul colecţiei naţionale de prun, cele 16 genotipuri urmând a fi studiate atât în aceasta fază, cât şi în fazele următoare.
DISEMINAREA REZULTATELOR
Contribuție Coordonator proiect (CP- USAMV București):
P1- INCDA Fundulea
Publicare articol științific: Ciucă Matilda, Turcu Alina-Gabriela, Conțescu Elena-Laura și Cristina Daniel Metodă adecvată pentru extracția de ADN din semințe și frunze pentru studii genetice la grâu (Triticum aestivum L.), tomate (Solanum lycopersicum L.) și ardei (Capsicum annuum). Analele Institutului Naţional de Cercetare-Dezvoltare Agricolă Fundulea Vol.88/2020.
Participare la Workshop-ul on-line pe Zoom: Genotiparea speciilor autohtone și beneficiile unei baze de date a variațiilor genetice specifice, cu o comunicare științifică din rezultatele proiectului: Tehnici moleculare utilizate în studii de diversitate genetică.
P2- ICDP Pitești
Publicare articol științific: Chivu Mihai, Eugenia Mareşi, Madalina Butac. Genetic diversity in selected progeny of plum cultivar ‘Tuleu gras’. Fruit Growing Research vol. XXXVI.
Participare la Workshop-ul on-line pe Zoom: Genotiparea speciilor autohtone și beneficiile unei baze de date a variațiilor genetice specifice, cu o comunicare științifică din rezultatele proiectului: Variabilitate fenotipică la unele soiuri autohtone de măr și prun.
P3- INCDBH Ștefănești
Publicare articol științific: Adriana Bădulescu, Carmen F. Popescu, Anamaria M. Dumitru, Dorin I. Sumedrea. New varieties of tomato – morphological aspects and molecular characterisation with RAPD and SSR markers, Notulae Scientia Biologicae.
Participare la Workshop-ul on-line pe Zoom: Genotiparea speciilor autohtone și beneficiile unei baze de date a variațiilor genetice specifice, cu o comunicare științifică din rezultatele proiectului: Soiuri noi de tomate omologate la INCDBH Ștefănești – aspecte morfologice și caracterizarea moleculară cu markeri RAPD și SSR.
INCDBH Ștefănești a organizat în data de 5.08.2020 un Workshop: ”Ziua porților deschise – sărbătoarea tomatelor”. Au fost prezenți invitați de la Universitatea din Pitești, fermieri din zonă – cultivatori de legume, specialiști de la Direcția pentru Agricultură și Dezvoltare Rurală Argeș. Au fost prezentate soiurile de tomate obținute la INCDBH Ștefănești (inclusiv cele analizate în acest proiect), s-a organizat degustare din fiecare soi și s-au întocmit fișele de evaluare a indicatorilor de calitate pentru fiecare varietate prezentată.
INDAGRA 2019 – Soiuri și varietăți de plante pretabile pentru culturi horticole ecologice
Director de proiect: CS III dr. ing. Anca Amalia UDRIȘTE
Email: [email protected]
Tel. +40 753 886 677
Responsabil implementare proiect și coordonare parteneri: Prof. dr. Liliana BĂDULESCU
Email: [email protected]
Tel. +40 745 368 898
